La enzima Cas13 estable al calor podría conducir a mejores diagnósticos y nuevas aplicaciones biotecnológicas

Una proteína de una bacteria amante del calor permite la detección específica del SARS-CoV-2 y otros virus en un ensayo de un solo recipiente basado en la tecnología RT-LAMP. Esta prueba podría simplificar los diagnósticos en el punto de atención de COVID-19 y otras infecciones.

Las pruebas RT-LAMP son similares a las pruebas PCR: detectan pequeñas cantidades de material genético viral en una muestra amplificándola a cantidades detectables. Una ventaja de una prueba de RT sobre las pruebas de PCR es que se realiza a una sola temperatura (55 a 65 grados Celsius) en lugar de ciclos repetidos a diferentes temperaturas. Esto hace que sea más rápido y fácil de usar. Sin embargo, su desventaja es que no es tan precisa como la PCR, ya que puede producir resultados falsos positivos.

“Si se pudiera combinar un factor de especificidad adicional con RT-LAMP para distinguir entre amplificación verdadera y falsa, podría ayudar a desarrollar tecnologías de diagnóstico poderosas”, dice KAUST Ph.D. estudiante Ahmed Mahas.

Mahas y un equipo de científicos que trabajan en el laboratorio de Magdy Mahfouz querían encontrar un sistema CRISPR-Cas que pudiera usarse con RT-LAMP para detectar específicamente material genético objetivo en un ensayo de un solo recipiente sin necesidad de nuevos reactivos. Las proteínas cas son la línea de defensa de las bacterias contra los patógenos invasores y se han utilizado para detectar ARN amplificado. Sin embargo, la mayoría de las proteínas Cas13 dirigidas al ARN funcionan a alrededor de 37 grados centígrados, lo que es incompatible con RT-LAMP. El equipo quería encontrar una enzima Cas13 que se dirija al ARN viral y sea estable a las temperaturas utilizadas en las pruebas RT-LAMP.

Buscando en las bases de datos de proteínas Cas, encontraron un candidato prometedor perteneciente a una bacteria termófila (amante del calor) llamada Herbinix hemicellulosilytica. Una búsqueda adicional a través de bases de datos de proteínas identificó otra proteína Cas con una secuencia genética similar en un termófilo llamado Thermoclostridium caenicola. Las pruebas mostraron que ambas proteínas Cas eran estables a temperaturas relativamente altas, pero la proteína TccCas13a perteneciente a T. caenicola se mantuvo estable dentro de un rango más alto (37 a 70 grados Celsius).

Luego de más pruebas y optimizaciones, el equipo pudo usar TccCas13a para desarrollar un ensayo de un solo recipiente sensible, robusto y rápido llamado OPTIMA-dx.

La prueba utiliza RT-LAMP para amplificar la cantidad de ARN de virus objetivo en una muestra. Luego, TccCas13a lo reconoce y lo corta, activándolo para que también corte los ARN especiales marcados con fluorescencia que se agregan a la mezcla. Esto produce una señal fluorescente que puede ser leída por una aplicación móvil también desarrollada por el equipo.

OPTIMA-dx detectó con éxito el SARS-CoV-2 en muestras de pacientes. También se modificó para detectar otros virus, como el de la hepatitis C, o incluso varios virus al mismo tiempo. La tecnología ha sido patentada, se ha producido un prototipo y se ha validado clínicamente, y el equipo ahora está haciendo la transición del producto a una fase de puesta en marcha con el objetivo de producirlo y comercializarlo en masa.

“Encontrar la enzima termoestable TccCas13a es solo el comienzo”, dice Mahfouz. “Ahora estamos investigando otros sistemas para desarrollar tecnologías disruptivas de inspiración biológica para el cuidado de la salud, la terapia y el diagnóstico”.

La investigación se publica en procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias.

Subiendo la temperatura para desbloquear el potencial de Cas13 de KAUST Research en Vimeo.